基因修饰细胞疗法是一种新型免疫治疗手段，主要有 CAR-T、TCR-T、CAR-NK、TCR-NK、CAR-M 等技术手段，其中嵌合抗原受体T细胞免疫疗法 (Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T) 因其在血液肿瘤中的显著疗效而成为肿瘤免疫治疗领域中的研究新热点。根据 ASGCT  2023年 Q1 报告统计，全球基因修饰细胞疗法研发管线中，CAR-T 独占鳌头，占比48% [1]，是目前应用最广泛的基因编辑细胞疗法。
 

回顾 CAR-T 的发展历史，我们可以看到全球 CAR-T 临床研究从2008年起步，随着项目数量逐年上升和技术的不断创新，2013年进入全面爆发阶段。在早期的临床试验中，采用 CAR-T 疗法治疗 B 细胞急性淋巴细胞白血病(ALL) 或B 细胞淋巴瘤的患者取得了巨大的成功，彻底改变了血液恶性肿瘤的治疗方式[2]。2017年，全球首款免疫细胞治疗CAR-T 产品 Kymriah 获美国FDA 批准上市，用于治疗25岁以下复发或难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病，这个细胞疗法领域的里程碑事件，标志着 CAR-T 疗法正式进入高速发展阶段。截至目前，美国 FDA 已批准 6 款 CAR-T 疗法上市，中国 NMPA 已批准 3 款 CAR-T 疗法上市。这些已上市的 CAR-T 产品适应症大多为血液肿瘤，随着适应症不断扩大、CAR-T 实体瘤研发热情高涨、医疗支付手段多样化提升患者可负担能力、通用性 CAR-T 开发进一步降低成本等[3]，CAR-T 市场规模将不断扩大。据 Frost & Sullivan 分析数据显示，2030年全球 CAR-T 市场规模预计将达至 217.8 亿美元，2025-2030年预计复合年均增长率 19% 。
 

Fig1. 全球已上市 CAR-T 疗法（根据行业报告[4]和公开资料整理）
 

CAR-T 细胞疗法，是过继性免疫疗法的一种，是将体内的T 淋巴细胞进行分离提取，通过基因工程技术改造、加工、培养 T 细胞，并将扩增好的 CAR-T 细胞回输至患者体内，使 T 细胞能够以不依赖于主要组织相容性复合体 (MHC) 的方式精准识别肿瘤相关抗原(TAA) 并与之结合而被激活，通过释放穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞达到治疗目的，其核心就是设计并构建特异性的肿瘤嵌合抗原受体 (Chimeric Antigen Receptor, CAR) ，CAR 是模块化合成受体，由一个细胞外靶抗原结合域 (single-chainvariable fragment, ScFV, 由抗体的可变轻链VL、可变重链VH 和中间的Linker组成，负责识别肿瘤抗原)，一个铰链域 (Hinge结构域)，一个跨膜结构域 (支持 CAR 分子锚定在细胞膜上，起稳定性作用) 和一个或多个胞内信号传导域等四个主要部分组成[5]。 
 

CAR-T 疗法自开创以来，经历了四代技术更迭。第一代CAR 通常带有 CD3ζ 胞内信号传导域以支持 TCR 信号传导；第二代在第一代的基础上增加了一个共刺激体(CD28 或 4-1BB)，共刺激体与 CD3ζ 信号传导域偶联，使 T 细胞能够在 CAR 的 scFv 区域识别抗原后激活和增殖，进而增强 CAR-T 细胞的存活时间和抗肿瘤效果，是许多临床期 CAR-T 产品的模板；第三代 CAR 在第二代 CAR 的基础上增加了第二个共刺激结构域，再次增强了 CAR-T 细胞的增殖和治疗效果；第四代 CAR 是在第二/三代 CAR 的基础上共表达细胞因子或趋化因子，如 IL-7、IL-15、IL-18、IL-12、CCL19、CCL22，可促进 T 细胞增殖，提升 T 细胞效应，招募和活化更多的免疫细胞，增强 CAR-T 细胞杀肿瘤效应。
 

Fig2. CAR-T 发展历程[6]
 

01 CAR-T 生产工艺开发策略及考量
 

CAR-T 疗法的生产工艺，主要包括 5 个步骤：通过单采或外周静脉血收集外周血单核细胞(PBMC)——T 细胞分选和活化——使用病毒（一般为慢病毒载体或逆转录病毒载体）或非病毒载体进行CAR 结构改造——体外 CAR-T 细胞扩增——末端工艺和冷冻保存。成功的 CAR-T 工艺开发需要做到以下几点：
 

1.  初步 QTPP 设定
 

基于 QbD 质量源于设计理念，工艺开发首先需要设定初步的目标产品质量属性(Quality Target Product Profile, QTPP)，QTPP 可参考早期的研发数据、法规/指导原则、或已上市产品进行设定。CAR-T 产品的质量控制具体主要表现在四个方面：安全性Safety、纯度Purity、效力Potency、均一性Identity/strength。
 

Fig3. CAR-T 质量控制策略
 

2.  工艺路线设计
 

工艺路线设计主要的考量点有：是否可以满足初步设定的QTPP、工艺稳健性、自动化封闭式、经济性等。工艺路线确定后，每个步骤环节需要确定使用的技术和设备，如起始材料、T细胞分选激活试剂、CAR 转导方式（如逆转录病毒、慢病毒等病毒载体或转座子转染、电穿孔等技术等非病毒载体方式）和转导条件优化、细胞扩增（如Wave 反应器、G-Rex、cell culture bag、Prodigy等）、收获及洗涤、制剂和冻存等主要环节。
 

Fig4. CAR-T生产流程及用到的主要技术和设备[7]
 

3.  工艺开发
 

工艺开发的主要目的是鉴定出关键工艺参数(Critical Process parameter，CPP)、确定工艺操作空间、工艺性能评估（如性能数据，杂质清除和成品质量属性数据）等。CAR-T 工艺开发过程中，CAR 转导和 CAR-T 细胞扩增是关键的工艺步骤，那么，在 CAR 转导关键工艺步骤中如何才能获得更高更稳定的基因导入效率呢?
 

以不同转导容器及是否加入 RetroNectin 为例，药明生基细胞工艺开发平台分析了这两个参数对 CAR 转导效率的影响，结果显示不同类型的培养袋对 CAR 转导效率有显著影响。确定好 CPP 后，还需进一步确定关键工艺参数的操作空间范围。
 

Fig5. 不同转导容器对转导效率的影响
 

基于慢病毒载体的 CAR 转导是关键的工艺步骤，高质量的慢病毒载体是 CAR-T 药物有效性及安全性的保证。药明生基具有独立知识产权的 HEK293 慢病毒悬浮生产细胞（无SV40 LT，更安全）和 OXGENE 的包装质粒，遵循QbD 原则，进行了上下游生产工艺参数优化，建立了工艺操作简单、易于放大、收率稳定的悬浮 LVV 工艺，从源头提高细胞药物产业化效率，降低成本。
 

4.  工艺性能评估
 

CAR-T 细胞的工艺性能评估包括：性能数据，杂质清除和成品质量属性数据等。如 PBMC 有分离后使用和冻存后使用两种工艺，因此工艺评估时需要对这两种工艺进行比较。药明生基细胞工艺开发平台对新鲜单采血和冻存单采血的CD3+ T细胞回收率和纯度进行了分析，结果显示新鲜单采血的CD3+ T 细胞回收率约为60%，纯度为90-98%，而冻存单采血的回收率则为86%，纯度为90-99%。
 

Fig6. 使用CliniMACS Prodigy 分离CD4+/CD8+ T 细胞的效率
 

5.  细胞表型
 

另外一个重要的工艺开发考量点是细胞表型，T 细胞有较多亚型，细胞表型和 CAR 表达相关，而 CAR 表达强度与启动子有关，有文献报道，CAR 表达太强会引起 T 细胞耗竭，使抗肿瘤效应降低，选择内源性启动子则有更优秀的抗肿瘤效果。药明生基 OXGENE 团队可提供启动子筛选服务，利用生物信息学分析技术建立启动子库，筛选高、中、低等不同表达强度的启动子并进行验证，同时还可以提供组织特异性启动子筛选服务。
 

Fig7. 药明生基 T 细胞启动子筛选服务
 

02 药明生基细胞疗法 CTDMO 平台
 

药明生基细胞疗法 CTDMO 平台可提供自体/异体 CAR-T、TCR-T、CAR-NK、TIL、MIL、MSC 等各类细胞疗法服务，现有美国（宾夕法尼亚州费城LI1、LI2、CC3 共 3 个独立的厂房，共计 37000+ 平方米，拥有 30 多个 GMP 车间）和中国生产基地（无锡惠山基地共 2 条全封闭一次性工艺的生产线），拥有封闭式自动化的生产工艺、国际标准的生产设施、灵活的产能布局以及全球统一的质量体系，满足客户从临床前到商业化期间不同阶段的研发和生产需求，符合中国、美国和欧洲等不同地区法规要求。
 

Fig8. 药明生基 CAR-T CTDMO 服务平台
 

截至 2023 年第一季度，药明生基为 68 个项目提供了开发与生产服务，其中包括 52 个临床前和临床I期项目，8 个临床II期项目，8 个临床III期项目（其中 2 个项目处在上市申请审核阶段，2 个项目处于上市申请准备阶段）。
 

目前，药明生基已助力一家美国客户完成一个将成为世界首个创新肿瘤淋巴细胞疗法 (TIL) 项目的上市许可申请（BLA）；以及助力一家中国客户完成 CAR-T 细胞治疗的慢病毒载体 (LVV) 项目的 BLA，并顺利通过国家药品监督管理局食品药品审核查验中心(CFDI) 药品注册核查的现场延伸检查，成为中国首家通过 CFDI LVV 注册现场核查的CGT CDMO。