LcDNA在CGT领域中的应用开发

2023年12月8日

基因递送技术是将外源遗传物质定点递送至靶细胞、靶器官或靶组织中并进行表达的技术，是基因药物研发过程中的关键技术之一。目前用于基因疗法的载体主要分为两大类：病毒载体和非病毒载体，选择哪种递送系统取决于靶细胞及其特性、表达时间和目的基因大小。就非病毒载体来说，其细胞毒性、免疫原性和致突变性较低，载体容量大，且具有材料来源广泛、化学结构可控、易于大规模制备、所携带的目的基因不整合至宿主细胞基因组等优势。

图1. 基因载体分类

来源：Uresearch 全球CGT基因载体行业市场研究报告（2022-2026）

表1. 病毒载体和非病毒载体的对比

本期基因递送载体，我们将为您介绍非病毒载体 LcDNA 在细胞基因治疗领域中的工艺开发应用。

LcDNA (Linear closed end DNA)，即线性闭合末端DNA，在两端具有自由的、非连接的3' 和5' 末端，是一种小的、线性双链共价闭合DNA 结构，因其形状类似于“狗骨头”(doggybone)，也被称为dbDNA。将 LcDNA 导入目标细胞中，可实现对细胞内特定基因的引入和表达，常用于基因功能研究和基因药物开发。LcDNA 在临床应用及安全性上有较大优势，但工艺开发难，生产成本大，想要获得高表达量、高纯度、低杂质残留的 LcDNA 并非易事。

图2. LcDNA 模式图

LcDNA 工艺开发难点及应对策略

LcDNA 不携带骨架信息，仅表达目的基因，分子量小，细胞转染效率高。但往往因为平台技术不成熟、参数优化难、体系放大一致性差、工艺开发生产转化难，而导致LcDNA 工艺开发和生产困难重重。

不同于传统的用于病毒包装的DNA 载体， LcDNA 生产一般采用DNA 合成技术，即使用酶促反应原理进行规模化生产，生产快、产品纯度高。但与传统细菌发酵生产质粒DNA 载体的方法相比，成本较高。药明生基通过质粒开发平台上下游优势，根据产品特性进行实验设计，获取足够的原材料后再进行酶法制备，使得上游表达量和下游层析收率均可满足产能需求，显著降低生产成本。

图3. 药明生基LcDNA 生产流程

药明生基利用LcDNA产品特性，借助现有质粒工艺开发平台的优势，分别在上游发酵和下游纯化进行了工艺设计及优化策略。基于QbD的原则，通过设计DOE实验，搭建Scale down模型，不断优化产品反应体系，利用JMP软件进行线性拟合和数据处理分析，找到最优反应时间和酶活比例，确认最佳经济效益的大规模生产制备工艺。

图4. LcDNA 工艺设计与优化

上游高密度发酵——产量高，稳定性好，可放大

药明生基质粒上游开发，基于可授权的高表达菌株库，根据不同的产品类型筛选不同菌株进行扩增、培养基优化、发酵控制、补料策略等多种开发手段协同使用，以便达到高表达量的实验目的。通过单克隆筛选高表达量菌株进行高密度发酵，使得上游表达量提升至1000mg/L左右。在工艺转移上，无论是小试阶段还是生产规模，均展现出良好的一致性和稳健性。

图5. 药明生基LcDNA 平台工艺放大一致性

下游两步层析——质量和回收率的保障

LcDNA下游工艺通过两步层析策略，使得回收率大大提高，不同规模的总回收率均超过了40%（图6），且杂质含量符合工艺要求（图7），无论产品质量及回收率上具有一致性和稳健性。

药明生基质粒放行检测
药明生基质粒检测涵盖理化性质、鉴别、质粒纯度、安全性、杂质残留（HCDHCPHCR）等多个维度，从开发批到GMP生产批检测方法良好衔接，使得工艺具有一致性。除此之外，我们还可提供长期稳定性研究、使用稳定性研究、冻融稳定性研究、加速稳定性研究等，满足后续申报需求。

表2. 药明生基质粒放行检测项

不管是LcDNA，还是用于构建病毒载体的质粒，药明生基均具有丰富的工艺开发和生产经验。截至目前，药明生基已成功交付GMP质粒240+批次，拥有3条GMP生产线（5L~50L~200L）和1条GMP灌装线（可根据客户需求，支持75µL-100mL等不同规格的质粒产品灌装），实现年产60批，单批次质粒产量最高可达30g。