近年来，越来越多的细胞和基因疗法（Cell and Gene Therapy, CGT）安全性和疗效数据涌现，为多种疾病的治疗提供了新的可能性。慢病毒是当前细胞疗法广泛使用的病毒载体之一，其主流使用的生产系统是第三代慢病毒载体生产系统——四质粒共转染系统，即由1个包含目的基因的表达质粒 GOI 、2个包装质粒 Rev 和 GagPol 、1个包膜蛋白质粒 VSV-G 等 4 个质粒组成。
 

在四质粒共转染系统中，载体研发和生产面临成本过高的挑战，其中质粒 DNA 在细胞疗法药物开发生产成本中占比最高，符合 GMP 要求的质粒 DNA 价格达每克数万美元，在商业化生产规模下的不同工艺中占生产成本的18%-46%。有研究对比分析了五种生产慢病毒载体上游工艺的原材料成本拆分，在产量为 1000 剂/年的情况，对于固定床（FB333）、微载体（RMmc600）及搅拌罐（SUB500）生物反应器等生产规模更大、更适用于载体商业化生产的工艺而言，质粒DNA的成本占比最高，分别为 41%、46% 和 36%。
 

数据来源∶Biochemical Engineering Journal
 

因此，慢病毒载体的生产急需颠覆性的生产解决方案，来降低每剂次的成本以使更多产品得以进入临床及生产，最终惠及更多患者。而慢病毒稳定包装悬浮细胞系因其具有更好的可放大性、安全性及更低的成本，正在成为细胞疗法行业未来发展的重要方向。
 

作为专注于创新的全球化CTDMO，药明生基旗下OXGENE 团队开发了悬浮式LentiVV稳定表达细胞系LentiVV Packaging Cell Line和LentiVV Producer Cell Line。LentiVV Packaging Cell Line 是将Rev、GagPol 和VSV-G 等慢病毒包装原件整合到现有的悬浮HEK 293 细胞的基因组中，与传统的四质粒转染生产技术相比，LentiVV Packaging Cell Line 只需要一个质粒，显著降低了质粒生产成本和工艺开发复杂性。而基于 Packaging Cell Line 开发的 LentiVV Producer Cell Line 则是将 GOI 转移质粒也整合进入 Packaging Cell Line 基因组中，提供了一种无需质粒的慢病毒载体生产方法，节约了质粒成本和转染试剂成本、降低了操作复杂性并显著提高了工艺稳健性。
 

同时，LentiVV Packaging Cell Line 和 Producer Cell Line 能够实现与四质粒转染方法相当甚至更高的慢病毒载体产量及产率，为大规模慢病毒载体生产提供了更加低成本、高效便捷的解决方案。
 

Fig 1. LentiVV Packaging Cell Line和LentiVV Producer Cell Line 技术原理

Tab 1. LentiVV Packaging Cell Line、LentiVV Producer Cell Line和四质粒转染系统对比
 

LentiVV Packaging Cell Line——只需1个质粒，适合早期基因筛选和载体开发
 

药明生基的 LentiVV Packaging Cell Line，是将基于四环素诱导表达系统的 GagPol 和 VSV-G、Rev 等慢病毒载体包装原件稳定整合至 HEK293 生产细胞株中，通过多轮高通量筛选后，从数千个单克隆中筛选而得到的高产、稳定生产细胞株。Packaging Cell Line 和四质粒转染系统的对比研究结果显示，针对不同目的基因，Packaging Cell Line 生产的慢病毒滴度均相当于或高于四质粒转染系统（Fig 2）。
 

Fig 2. LentiVV Packaging Cell Line 和四质粒转染系统对不同目的基因的慢病毒载体生产能力比较
 

LentiVV Producer Cell Line——无需质粒转染，适合大规模生产，显著降低生产成本
 

基于转座子将目的基因整合进入 LentiVV Packaging Cell Line，药明生基进而开发出无需质粒转染的适合大规模生产的LentiVV Producer Cell Line 系统。利用LentiVV Producer Cell Line 生产不同目的基因的慢病毒载体，均达到了3×107 TU/mL以上的高滴度（Fig 3），与四质粒转染系统相比，LentiVV Producer Cell Line 生产的GFP 慢病毒载体滴度更高（Fig 4）。
 

LentiVV Producer Cell Line不需质粒，在大规模生产时可显著降低生产成本，那么大规模生产时其载体生产能力又如何呢，放大性研究结果显示放大到在生物反应器中的滴度高于E125 flask 规模，显示了该系统具有优秀的可放大性（Fig 5）。

Fig 3. 基于LentiVV Producer Cell Line 系统生产的不同目的基因的慢病毒载体滴度（24 deep-well plate scale）

Fig 4. LentiVV Packaging、LentiVV Producer Cell Line和四质粒转染系统慢病毒载体生产能力的比较（GOI=GFP，E125 flask scale）

Fig 5. LentiVV Producer Cell Line可放大性研究.（GOI=GFP/CARCD19，Flask = E125 flask. STR = 1 L生物反应器）
 

总结
 

药明生基LentiVV 慢病毒稳转细胞生产平台提供了一种先进的、成本更低、工艺开发更快更便捷、生产周期更短、可放大的慢病毒载体生产技术。LentiVV Packaging Cell Line 和 LentiVV Producer Cell Line 生产慢病毒载体的产量与4质粒瞬时转染系统相当甚至更高，这些一致的产量确保了从瞬时转染到LentiVV 慢病毒稳转细胞生产系统的精简过渡。